크로마토그래피 실험 예비리포트

1. 서론

1. 제목

크로마토그래피

2. 목적

크로마토그래피는 혼합물에서 각 성분을 분리하여 정성분석을 가능하게 하는 중요한 분석 방법이다. 이 실험에서는 정상 크로마토그래피에 의한 지시약의 분리 및 직접 합성한 아스피린의 전개를 통하여 혼합물의 분리를 확인하고자 한다.

2. 본론

1. 원리

자연에 존재하는 물질이나 실험실에서 합성한 화합물은 다른 물질과 섞여 있는 혼합물인 상태가 대부분이다. 화학실험에서 사용되는 분리방법에는 결정화 및 여과, 원심분리, 증류, 추출, 전기영동 등 다양한 방법이 있다. 그 중에서 크로마토그래피는 가장 많이 그리고 쉽게 사용되는 분리방법 중의 하나이다. 크로마토그래피는 혼합물의 각 성분을 물질의 분배계수에 따라서 분리하는 방법으로 정성분석뿐 아니라 정량분석도 가능하다.

크로마토그래피의 원리를 한마디로 요약하자면 '분배 평형'의 원리라 할 수 있다. 예를 들어 비극성 분자 M을 섞이지 않는 두 용매 즉, 극성용매 A와 비극성용매 B로 구성된 용액에 넣고 잘 흔들어 준 다음 방치하면, 극성용매 A와 비극성용매 B는 서로 섞이지 않고 층이 분리되는 현상이 나타난다. 이때 비극성 분자 M은 극성용매 A보다 비극성용매 B에 녹아 있게 된다. 이는 비극성 분자 M이 용매 A와 B 사이에 고르게 분배되지 않으며, 식으로 표현하면 다음과 같다.
$$ M(A)\rightleftharpoons M(B) $$
$$ K=\frac{[M_{(B)}]}{[M_{(A)})]} $$
여기서 K는 분배계수(distribution coefficient)라 부르고, 두 용매 A, B 사이에서의 용질의 농도비이다.

이러한 분배 평형의 원리는 이동상(액체 또는 기체)과 고정상(고체)이 존재하는 크로마토그래피에서도 적용할 수 있다. 혼합용질이 이동상에 섞여 고정상을 통과할 때, 각각의 용질은 서로 다른 분배계수 K를 갖게 된다. 이 때 고정상에 대한 분배계수 K가큰 용질일수록 고정상에 머무는 시간이 길어진다. 따라서 분배계수 K가 서로 다른 용질들은 일정한 길이를 갖는 고정상을 통과하는 시간이 서로 다르고 그들의 이동 속도가 달라져 혼합용질의 분리가 가능하게 된다.

용질이 고정상에 대해 서로 다른 분배계수를 갖는 근본적인 이유는 크게 두 가지로 분류된다. 첫 번째는 용질 분자와 고정상을 이루는 물질 사이의 상호작용하는 힘이 다르기 때문이다. 즉, 고정상이 극성을 띄는 물질(정상 크로마토그래피)로 이루어진 경우, 극성이 작은 용질 분자보다는 극성이 큰 용질 분자와 상호작용이 더 크게 된다. 반면에 고정상이 극성이 작은 물질(역상 크로마토그래피)로 이루어진 경우는 극성이 작은 용질 분자가 더 큰 상호작용을 하게 된다. 두 번째 이유는 각각의 용질이 이동상에 대해 서로 다른 용해도(상호작용)를 갖기 때문이다. 이동상에 대한 용해도가 큰 용질일수록 고정상에서의 이동속도가 빠르다.

이번 실험에서는 앞서 언급한 크로마토그래피의 기본원리를 배우기 위해 얇은 층(판, 막) 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)에 관한 실험을 하게 된다. 얇은 층 크로마토그래피에서는 고정상으로 극성이 큰 실리카겔을 유리판 위에 입힌 판을 사용하고, 이동상으로는 극성이 서로 다른 두 종류의 용매($ CH_{2}Cl_{2} $/$ CH_{3}OH $ 메틸렌 클로라이드/메탄올, $ C_{6}H_{14}(Hx)/CH_{3}COOCH_{2}CH_{3}(EA) $ 헥세인/에틸 아세테이드)가 혼합된 용액(전개액)을 사용한다. 또 용질은 브로모 페놀블루, 페놀프탈레인, 브로모 크레졸퍼플, 페놀레드 등 4종류의 지시약을 사용하고 혼합물의 분리실험을 위해서는 위 4가지 지시약 중에서 두 개의 지시약을 혼합하여 사용한다. 또한 지난 실험에서 합성한 아스피린 및 살리실산 등을 사용한다.

2. 기구 및 시약

2-1. 기구

TLC 판, TLC 전개병, 모세관, UV-lamp

2-2. 시약

전개용매 $ CH_{2}Cl_{2} : MeOH = 5 : 1(v/v) $, $ Hx : EA = 1 : 4(v/v) $, 시료용액(브로모 페놀블루, 페놀프탈레인, 브로모 크레졸퍼플, 페놀레드, 미지시료, 살리실산, 아스피린), 발색제($ NH_{3} $)

3. 방법 및 주의사항

1.방법

(1) TLC 판을 각 조별로 2개씩 준비한다.

(2) 첫 번째 TLC 판의 바닥에서 1 cm 정도 떨어진 곳에 연필로 점을 5개 나란히 찍는다(시료용액 찍을 위치를 연필로 미리 점을 찍은 후 그 점 위에 최소한의 시 료를 찍을 것).

(3) TLC 판에 준비된 4가지 시료용액(브로모 페놀블루, 페놀프탈레인, 브로모 크레 졸퍼플, 페놀레드) 및 혼합 미지시료 각각을 모세관에 묻힌 후 TLC 판에 차례로 찍고 완전히 말린다.

(4) 방법 (3)의 TLC 판을 $ CH_{2}Cl_{2} : MeOH = 5 : 1(v/v) $의 전개용매로 전개한다. 이 때 시료의 점들이 전개용매에 잠기지 않도록 TLC 판을 TLC 전개병에 세우고, 전개 용매가 증발하지 않도록 전개병의 뚜껑을 닫는다(TLC를 전개하는 동안 전개병을 이동하거나 움직이지 않는다).

(5) 전개액이 TLC 판의 위쪽 끝에서 1 cm 정도 떨어진 곳까지 도달하면 TLC 판을 꺼내어 연필로 용매라인을 즉시 표시한 다음 말린다. 후드에서 TLC 판을 암모니아 기체에 노출시켜 TLC 판의 색변화를 관찰 기록한다.

(6) 각각의 점에 대한 반점이 이동한 거리 및 전개용매가 이동한 거리를 측정하여, 각 지시약에 대한 $ R_{f} $(반점이 이동한 거리/전개용매가 이동한 거리) 값을 계산한다. 또 혼합시료에 들어있을 거라 추측되는 지시약을 기록한다.

(7) 지난 실험에서 합성한 재결정 전, 후의 아스피린 결정 및 살리실산을 각각 아주 소량 취하여 $ MeOH $에 녹여 시료로 준비한다(시험관 또는 25 mL 삼각 플라스크에 준비).

(8) 두 번째 TLC 판에 살리실산, 합성 아스피린, 시판 아스피린 및 페놀프탈레인을 같은 방법으로 점을 찍고 말린다.

(9) 이동상으로 전개용매 $ Hx : EA = 1 : 4(v/v) $를 사용한다. 역시 밀폐된 상태로 전개시켜야 한다.

(10) 전개된 TLC 판을 먼저 UV-램프(254 nm)를 쪼여 나타나는 현상을 연필로 그 리고 관찰한 다음 후드에서 TLC 판을 암모니아 기체에 노출시켜 TLC 판의 변화 를 관찰 기록한다. 위 실험 결과로 얻은 $ R_{f} $값을 측정한다.

(11) 아스피린 TLC 경우 합성한 아스피린과 출발물질인 살리실산의 $ R_{f} $값을 비교해 서 반응하지 않은 출발물질이 남아 있는지 확인한다.

2. 주의사항

1. TLC 판에 너무 많은 양의 시료가 spotting되어 서로 점이 겹치지 않도록 주의한다.
2. 해당 전개용매(이동상)를 전개병에 넣고 시료가 spotting된 TLC 판을 넣고 전개를 시킬 때, 전개병을 움직이지 말고 실험대에 놓고 안정된 상태에서 전개시키면서 관찰한다.
3. 시료를 전개시킬 때 전개병의 뚜껑은 항상 닫아 전개용매가 포화된 상태로 전개한다.
4. 발색제로 사용하는 암모니아 기체는 후드에서 사용한다.
5. UV-램프를 이동시키거나 사람을 향하지 않도록 주의한다.